On le retrouve ensuite à Naples, puis à Rome, au service de Constantino Castrioto, chevalier de l'ordre de Malte et, en 1553, il est nommé maître de chapelle de Saint-Jean-de-Latran. Ces voyages lui permettent de diversifier sa formation et, notamment, d'étudier à fond l'art italien.

Après un séjour en Angleterre, ses premières oeuvres paraissent simultanément à Anvers et à Venise. Engagé comme ténor à la cour du duc Albert V de Bavière, il est nommé en 1563 maître de chapelle de la cour à Munich.

Bien qu'il occupe ce poste jusqu'à sa mort, il n'en continuera pas moins à voyager, entretenant des relations avec plusieurs cours européennes. L'aide matérielle qu'il en retire lui permet de s'éloigner de la vie de cour à partir de 1580, pour se consacrer à son oeuvre religieuse.

Reflet de son expérience et de ses voyages, l'oeuvre de Lassus est aussi diverse que prolifique. Il s'est exprimé abondamment dans tous les genres (motets, messes, magnificat, madrigaux, chansons françaises, Lieder, hymnes, psaumes, passions).

Le « mirabile Orlando », « Prince des musiciens de notre temps » est joué à travers toute l'Europe. S'il n'innove pas, ne créant aucun genre nouveau, il approfondit et enrichit les formes existantes. Parmi les oeuvres profanes, les Madrigaux à 5 voix dominent en nombre et en importance.

Contrairement à ses prédécesseurs, il laisse le texte déterminer la forme musicale, conférant ainsi une vérité et une fermeté à un genre d'expression jusque-là plus maniériste. Avec Lassus, la Chanson française, pittoresque, burlesque, grivoise ou élégiaque, apparaît comme la synthèse des différentes illustrations du genre vers le milieu du XVIe siècle, après Janequin.

Profondément croyant, Lassus fut très marqué par la Contre-Réforme à laquelle il avait ardemment adhéré. Il composera 53 messes et 37 magnificat, mais ce sont les motets - il en écrivit 700 - qui constituent la part la plus admirable et la plus significative de son oeuvre. Ils sont à la fois l'aboutissement de la polyphonie flamande et son épanouissement sous l'influence italienne.

C'est aussi le mode d'expression dans lequel il se révèle le plus inventif, surprenant constamment par les ruptures de ton, l'opposition de l'homophonie et de la polyphonie, ou encore l'usage du chromatisme et de la déclamation. Dans le Double choeur, enfin, Lassus touche à des sommets d'émotion et de spiritualité, comme dans les cycles des Prophéties des Sybilles, les Lamentations du prophète Jérémie ou les Psaumes de la pénitence à 5 voix.